Antibiotikaresistenzen und Sepsis zählen zu den größten Herausforderungen der modernen Medizin. Das Forschungsprojekt ASTANA eröffnet neue Perspektiven für eine schnellere Diagnostik:
Auf Basis der digitalen holographischen Mikroskopie entwickelte das ILM gemeinsam mit Partnern eines interdisziplinären Forschungsverbunds ein neuartiges Verfahren, um die Antibiotika-Resistenztestung deutlich zu beschleunigen.
Jahrzehntelang galten Antibiotika als eine der verlässlichsten Waffen der modernen Medizin. Heute ist ihre Wirksamkeit keine Selbstverständlichkeit mehr: Die WHO zählt Antibiotikaresistenzen zu den zehn größten globalen Gesundheitsrisiken. Schätzungen zufolge könnten bis 2050 weltweit jährlich bis zu zehn Millionen Menschen an Infektionen mit resistenten Erregern sterben.
Die Zahl klingt abstrakt, aber ihre klinische Konsequenz ist konkret und zeigt sich besonders deutlich bei der Sepsis. Als schwerste Form einer Infektion verläuft eine Sepsis stets lebensbedrohlich. Mit rund 90.000 Todesfällen pro Jahr in Deutschland fordert sie mehr Todesopfer als beispielsweise Herzinfarkt oder Schlaganfall. Was den Verlauf einer Sepsis entscheidet, ist vor allem eines: Zeit.
Verzögerungen beim Therapiebeginn wirken sich unmittelbar auf die Überlebenschancen der Patienten aus. Je früher eine gezielte Antibiotikagabe erfolgt, desto besser die Prognose. Da viele ursprünglich wirksame Substanzen angesichts der zunehmenden Antibiotikaresistenzen an Wirksamkeit verlieren, wird die schnelle Identifizierung des sepsisauslösenden Erregers sowie seines Resistenzprofils immer wichtiger und ist Gegenstand intensiver Forschung. Der BMFTR-geförderte Forschungsverbund ASTANA zielte deshalb darauf ab, hochsensitive Testsysteme für die Sepsisdiagnostik zu entwickeln.
Das Problem liegt auch in der Diagnostik selbst: Etablierte Methoden zur Bestimmung der Antibiotikaempfindlichkeit – sogenannte Antimicrobial Susceptibility Tests (AST) – erfassen nicht einzelne Bakterien, sondern das Wachstum ganzer Populationen. Verfahren wie der Agardiffusionstest oder automatisierte turbidometrische Systeme messen, ob und wie stark ein Antibiotikum das Wachstum hemmt, und bestimmen daraus die minimale Hemmkonzentration (MIC).
Entscheidend für die Testdauer ist dabei die Zeit, die Bakterien benötigen, um sich zu verdoppeln – ein biologischer Prozess, der sich nicht beliebig beschleunigen lässt. Da die gegenwärtig verwendeten Verfahren auf messbare Veränderungen einer ausreichend großen Population angewiesen sind, vergehen zwischen Probenentnahme und fertigem Antibiogramm häufig mehr als 48 Stunden. In kleineren Krankenhäusern ohne eigenes Labor verlängern zusätzliche Transportwege diese Zeitspanne weiter. In dieser Zeit ist der Patient möglicherweise nicht optimal behandelt.
Der Ansatz der aktuellen Forschung: genauer hinschauen. Statt auf klassische messbare Endpunkte zu warten, rücken dynamische Veränderungen in frühen Wachstumsphasen in den Fokus. Die zentralen Fragen dabei: Lässt sich die Anzahl der für einen Test erforderlichen Bakterien weiter reduzieren? Und können neue Technologien aus Optik, Bildanalyse und Mikrofluidik dazu beitragen, mikrobielle Aktivität verlässlich zu erfassen, bevor konventionelle Messverfahren überhaupt anschlagen?
Um die Resistenzdiagnostik zu beschleunigen, rücken zunehmend einzelzellbasierte Verfahren in den Fokus. Die Zeit bis zur Resistenzbestimmung verkürzt sich dadurch auf etwa vier bis acht Stunden.
Einen besonders vielversprechenden Ansatz stellt das Quantitative Phase Imaging (QPI) dar. Der Begriff beschreibt eine Gruppe bildgebender Verfahren, die Veränderungen im Brechungsindex biologischer Proben quantitativ erfassen. Im Gegensatz zu klassischen markerfreien Methoden wie Phasenkontrast- oder differentieller Interferenzkontrastmikroskopie liefert QPI nicht nur kontrastreiche Bilder ungefärbter Zellen, sondern auch quantitative Informationen über Morphologie und Trockenmasse lebender Zellen – ohne diese zu markieren oder zu beeinflussen.
Da QPI nur sehr geringe Lichtdosen benötigt, lassen sich Zellen über längere Zeiträume nahezu störungsfrei beobachten. Veränderungen unter Einwirkung eines Medikaments oder Antibiotikums können dadurch in Echtzeit verfolgt werden. In Kombination mit KI-gestützter Bildverarbeitung eröffnet QPI neue Möglichkeiten für die markerfreie Zelldiagnostik in drei Dimensionen: Zelluläre Reaktionen werden automatisiert analysiert und selbst kleinste Veränderungen frühzeitig erkannt. Damit besitzt die Technologie das Potenzial, aufwendige markerbasierte Verfahren im Hochdurchsatz-Screening teilweise zu ersetzen. Auch im ASTANA-Projekt können die Vorteile des QPI eingesetzt werden, um Antibiotika-Resistenztestungen deutlich schneller sowie kosteneffizienter zu machen.
Die digitale holographische Mikroskopie (DHM) setzt das Prinzip des Quantitative Phase Imaging konkret um. Kollimiertes Laserlicht wird durch einen Strahlteiler in zwei Pfade aufgeteilt: Ein Pfad beleuchtet die Probe, der andere dient als Referenzwelle. An der Kamera überlagern sich beide Wellen und erzeugen ein Hologramm. Dieses enthält nicht nur Intensitätsinformationen, sondern auch die Phaseninformation des Lichts. Genau diese Phaseninformation macht einzelne Bakterien im Sichtfeld sichtbar.
Gegenüber anderen, komplexeren QPI-Verfahren wie der Holo-Tomographie bietet DHM einen entscheidenden Vorteil: sie ist sehr schnell. Bereits eine einzelne Aufnahme im Millisekundenbereich genügt, um daraus ein dreidimensionales Volumen rund um die Fokusebene rekonstruieren zu können. Dadurch lassen sich definierte Volumina von Zellsuspensionen in Vielfachprobenträgern automatisiert erfassen und quantitativ auswerten. Bei einer Prozessierungsdauer von etwa einer Sekunde pro Probenkammer kann ein kompletter Durchlauf mit 60 Kammern beispielsweise innerhalb einer Minute analysiert werden. So wird es möglich, mittels automatisierter Hochdurchsatzmessungen Wachstumsdynamiken in Vielfachprobenträgern mit hoher zeitlicher Auflösung zu verfolgen.
Da DHM bereits bei sehr niedrigen Zelldichten mit hoher Sensitivität arbeitet, können bakterielle Reaktionen auf Antibiotika bereits unmittelbar nach Beimpfung des Probenträgers beobachtet werden. So lassen sich Wachstum und Wirkstoffeffekte in mikrofluidischen Kartuschensystemen nahezu in Echtzeit analysieren. Im Projekt ASTANA wurde dieser Ansatz durch die Entwicklung und funktionelle Validierung eines Off-Axis-DHM-Systems umgesetzt.
Die Entwicklung des ASTANA-Systems erforderte ein enges Zusammenspiel aus Optik, Mikrofluidik, Software-Entwicklung und Systemintegration. Die Entscheidung für die digitale holographische Mikroskopie als Kernverfahren prägte dabei den gesamten Entwicklungsprozess.
Ausgangspunkt war ein klar definierter diagnostischer Workflow. Zunächst erfolgt die Probengewinnung und Anzucht, gefolgt von der Erregeridentifikation mittels MALDI-TOF, einem etablierten massenspektrometrischen Verfahren zur schnellen Keimbestimmung. Im nächsten Schritt werden antimikrobielle Empfindlichkeitstests auf einer zentrifugal-mikrofluidischen Plattform durchgeführt. Nach Beimpfung der Testkartusche erfolgt die Analyse des Bakterienwachstums und damit die eigentliche Resistenzbestimmung auf Basis der Phasenbilder aus DHM.
Eine zentrale Rolle spielte dabei die Entwicklung der mikrofluidischen Testkartusche. Hahn-Schickard bringt langjährige Erfahrung in der Realisierung zentrifugaler Mikrofluidiksysteme für automatisierte Arbeitsabläufe in der In-vitro-Diagnostik ein. Die Testträger ähneln dabei CD- oder DVD-Systemen mit integrierten Vorratskammern, Kanälen und Ventilen. Durch die Rotation des Trägers können Flüssigkeiten gezielt transportiert, gemischt und in Inkubationskammern überführt werden. Dort lassen sich biochemische Reaktionen automatisiert beobachten und optisch auswerten.
Im Projekt ASTANA wurden speziell kleine Inkubationskammern entwickelt, in denen das Wachstum von Bakteriensuspensionen jeweils in Gegenwart unterschiedlich konzentrierter Antibiotika untersucht wird. Ein paralleles Screening wird durch wiederholte Bestimmung der Bakteriendichten innerhalb fixer Zeitintervalle durchgeführt und ermöglicht so die schnelle Identifikation einer wirksamen Therapie für den Patienten. ILM und Hahn-Schickard entwickelten hierfür gemeinsam ein Chipdesign, das sowohl biologischen Anforderungen als auch den optischen Bedingungen der holographischen Bildgebung gerecht wird. Entscheidende Parameter waren die Minimierung der Oberflächenrauheit des Polymerchips zur Reduktion von Störsignalen, die präzise Positionierung der Kammern in allen drei Raumachsen sowie die Optimierung von Sehfeld und lateraler Auflösung für ein möglichst großes Auslesevolumen. Das ILM unterstützte insbesondere bei der Gestaltung der Kammern sowie bei der Analyse und Verbesserung der optischen Materialeigenschaften für eine störungsfreie DHM-Bildgebung.
Parallel dazu trieb BioFluidiX die Integration aller Komponenten in ein Gesamtsystem voran. Neben der optischen Einbindung mussten auch die Rotationsmechanik sowie stabile Umgebungsbedingungen hinsichtlich Vibrationen, Luftströmungen und Temperatur sichergestellt werden.
Die holographische Auswertung erforderte darüber hinaus eigene algorithmische Lösungen. Dazu gehörten die numerische Refokussierung eines definierten Kammervolumens und die dreidimensionale Rekonstruktion ohne mechanischen Z-Scan ebenso wie Verfahren zur Bakterienerkennung, Hintergrundreduktion und synthetischen Referenzbildung. Gleichzeitig wurde das Signal-Rausch-Verhältnis kontinuierlich optimiert.
Auf dieser Grundlage entwickelte IMFusion einen Deep-Learning-Algorithmus, der Bakterien automatisiert erkennt und präzise zählt. In einem iterativen Entwicklungsprozess zwischen ILM und IMFusion wurden die Softwaremodule fortlaufend evaluiert und verbessert.
Das Ergebnis ist eine integrierte Plattform zur schnellen und automatisierten Antibiotikaempfindlichkeitsprüfung, die das Potenzial besitzt, die mikrobiologische Diagnostik deutlich zu beschleunigen.
Die Umsetzung des ASTANA-Systems stellte das Entwicklungsteam vor konkrete technische Herausforderungen. Im Zentrum stand die Frage, wie ein holographisches Messsystem stabil und reproduzierbar genug für den klinischen Einsatz werden kann.
Eine zentrale Hürde war die Phasenstabilität des optischen Aufbaus. Durch gezielte Anpassungen im Beleuchtungskonzept sowie durch Einsatz eines Lasers mit kürzerer Kohärenzlänge, konnte die Bildqualität signifikant verbessert werden. Zusätzlich wurde am ILM eine Methode entwickelt, vibrationsbedingte Störsignale durch synchronisierte Kurzzeitbelichtung zu reduzieren. Damit entstehen stabile, auswertbare Hologramme auch unter realen Laborbedingungen.
Die Quantifizierung von Bakteriensuspensionen beider Modellorganismen gelang über zwei Größenordnungen reproduzierbar. Eine systematische Analyse der relevanten Parameter, darunter die Bakterienform und -größe, die Suspensionsdichte, die Ausdehnung der Testkammer in z, sowie deren Auswirkungen auf das Signal-Rausch-Verhältnis, lieferte wichtige Grundlagen für die Weiterentwicklung des Systems (Die Ergebnisse wurden im Journal of Biomedical Optics publiziert).
Nach erfolgreicher Systemeinhausung und passiver Schwingungsdämpfung erfolgte die Integration des optischen Systems bei BioFluidiX. Das ILM begleitete diesen Prozess aktiv durch gemeinsame Optimierung der Schnittstellen. Den Abschluss bildete eine klinische Validierung am Universitätsklinikum Ulm, bei der kinetische Messungen an Modellorganismen und Patientenproben die Funktionsfähigkeit des ASTANA-Systems unter realen Bedingungen bestätigten.
Trotz der im Projekt ASTANA erzielten Fortschritte konnte weiterer Optimierungsbedarf identifiziert werden, der im Nachfolgeprojekt ASTANA 2 gezielt adressiert wird. Ziel ist die Weiterentwicklung des bestehenden Funktionsmusters zu einem flexibleren und anwendungsnäheren DHM-Prototypen.
Ein Schwerpunkt liegt auf dem Probenhandling und der Durchführung von Replikatmessungen. Das in ASTANA realisierte zentrifugal-mikrofluidische Konzept bot bislang keine Möglichkeit zur kontinuierlichen Durchmischung der Probe oder zu Messungen an mehreren lateral versetzten xy-Positionen innerhalb einer Probenkammer. Beide Ansätze erwiesen sich in Testmessungen jedoch als vorteilhaft, um die Homogenität der Bakteriensuspension sicherzustellen und Zellkonzentrationen zuverlässiger zu erfassen. Der in ASTANA II entwickelte Prototyp soll deshalb um einen Schüttelmodus sowie um Mehrfachmessungen innerhalb einer Kammer erweitert werden.
Auch Sensitivität, Dynamikbereich und Signal-Rausch-Verhältnis der Messung sollen verbessert werden. Das bisherige ASTANA-System ermöglichte die Analyse eines Volumens von etwa 2,88 nl, wodurch die Quantifizierung der Bakteriendichte über rund zwei Größenordnungen möglich war. In ASTANA II soll das analysierbare Volumen auf etwa 37,5 nl erhöht werden. Dadurch können voraussichtlich deutlich niedrigere Zellkonzentrationen – bei vergleichbarem Signal-Rausch-Verhältnis – zuverlässig detektiert und der Dynamikbereich der Messung erweitert werden. Zusätzlich soll ein Dunkelfeldmodus vergleichend untersucht und bei erfolgreicher Validierung zur Reduktion von Hintergrundsignalen implementiert werden.
Ein weiterer Entwicklungsschritt betrifft das Testträgerformat. Während ASTANA auf ein projektspezifisches Kartuschensystem ausgelegt war, soll der neue Prototyp standardisierte Mikroplattenformate unterstützen. Dies schafft größere Flexibilität für zukünftige Assay-Designs und ermöglicht die Umsetzung unterschiedlicher, mittels DHM auswertbarer Testformate durch gezielte Softwareanpassungen.
ASTANA II ist ein durch den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) und das Land Baden-Württemberg gefördertes Forschungsprojekt. Ziel ist es, den Technologiereifegrad des bestehenden Systems von TRL 4 auf TRL 6 zu steigern und damit den Übergang von einem Labor-Funktionsmuster zu einem praxisnahen Prototypen zu realisieren.
Langfristig verfolgt ASTANA II das Konzept einer offenen DHM-Plattform. Durch die Kombination aus flexibler Hardware, anpassbaren Workflows und modularer Software sollen künftig unterschiedlichste DHM-basierte Testformate umgesetzt werden können. Perspektivisch sollen damit nicht nur Bakterien, sondern auch größere und optisch weniger anspruchsvolle Säugerzellen analysiert werden. Mögliche biomedizinische Anwendungsfelder reichen von der Wirkstoffforschung über die Immunanalytik bis hin zur Blutzell-Diagnostik.
Gruppenleiter Zell-, Molekularbiologie
E-Mail schreiben Tel: +49 (0)731 / 1429 115
Datenschutz-Einstellungen
Cookie Einstellungen
Diese Website verwendet Cookies die die Ihnen Services ermöglichen, die von externen Anbietern angeboten werden, wie z.B. YouTube oder Google Maps. Rechtsgrundlage ist hier Art. 6 DSGVO (1) a.
Sie können hier der anonymisierten Erfassung Ihres Nutzerverhaltens durch MATOMO widersprechen. Zu diesem Zweck speichern wir einen Cookie auf Ihrem Computer, um diese Entscheidung auch bei späteren Besuche zu respektieren.
Bitte beachten Sie, dass abhängig Ihrer Einstellungen einige Funktionen ggf. nicht zur Verfügung stehen.
Mehr Informationen finden Sie in unserer Datenschutzerklärung
