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Markierungsfreie Raman-Mikroskopie

Für die Untersuchung von lebenden Zellen unter physiologischen Bedingungen sind sensitive und nicht-invasive Methoden gefragt. Raman-Spektroskopie ist eine chemisch sensitive Methode, welche das Schwingungsverhalten der Moleküle auch im wässrigen Milieu liefert; die Kombination der Raman-Spektroskopie mit hochauflösender, konfokaler Mikroskopie generiert eine Matrix von kompletten Raman-Spektren an jedem konfokalen Bildpunkt.

Es gibt viele Forschungsfelder, die von einer markierungsfreien Untersuchung lebender Zellen profitieren können, z.B. die Untersuchung der Zelldifferenzierung, der Tumorprogression sowie von apoptotischen Prozessen.

Zell-Monolayer werden mit dem konfokalen Raman Mikroskop alpha 300 R (WITec GmbH) untersucht. Angeregt wird mit einem frequenzverdoppelten Nd:YAG-Laser bei 532 nm und 10 mW Leistung. Ein 63-fach vergrößendes Wasser-Immersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,0 erlaubt eine laterale Auflösung im submikrometer Bereich.

Raman Bilder können durch Integration über spezifische Raman Banden generiert werden. Eine Integration über die C-H Stretchschwingung ergibt ein Bild der ganzen Zelle. Die in der WITec-Software integrierte statistische Auswertung aller Spektren durch die Cluster Analyse berechnet die Verteilung der Regionen mit gleichem Spektrum. Das Spektrum einer Region um den Zellkern konnte dem Cytochrom C zugeordnet werden, ein Elektronen-Carrier in der mitochondriale Atmungskette und einer der ersten Marker der Apoptose Typ II.

Diese Methode eignet sich auch hervorragend um die chemische Zusammensätzung von Lebensmitteln oder Arzneimitteln zu untersuchen.

Fig. 1: Lokale Verteilung von Cytochrom C und zugehöriges Raman Spektrum nach Cluster Analyse.